|
|
|
|
|
 |
DNA를 분리, 정제하여 확인하는 방법으로는 아가로스 젤을 이용하는 전기영동법이 보편적으로 사용된다.
TotalcellDNA 분리 후 염색체 DNA와 플라스미드 DNA를 분리시킨다.
박테리어 파지 DNA의 분리
파지입자로부터 DNA의 분리
M13DNA의 분리
ds DNA(dsRF) 분리 : 플라스미드 분리 방법과 동일
ss DNA 분리
DNA의 분리 범위(kb)
|
|
|
 |
Ⅰ. 기본정보
Ⅱ. 서론 (Introduction)
1. PCR (polymerase chain reaction)
1-1. PCR의 원리
1-2. PCR의 과정
1-3. PCR의 주재료
2. PCR 결과 확인 (전기영동, electropH oresis)
3. 전기영동의 종류
3-1. 이동 계면 전기영동법 (Moving boundary electrophoresis)
3-2. 띠 전기영동법 (Zone electrophoresis)
3-3. 불연속 젤 전기영동법 (Disc-gel electrophoresis)
3-4. SDS젤 전기영동법
3-5. 아가로오스 젤 전기영동법 (Agarose gel electrophoresis)
Ⅲ. 실험재료 및 방법 (Materials & Methods)
1. 실험재료(Materials)
2. 실험 방법(Methods)
Ⅳ. 실험결과 및 결론 (Data and Results)
Ⅴ. 고찰 (Discssion)
1. 제 1 타입은 세포 전체 DNA(total cell DNA)이며 클로닝될 유전자를 얻기 위해 필요.
1-1. Total cell DNA의 분리
2. 제 2 타입은 순수한 플라스미드 DNA이며 분리방법은 기본적으로 total cell DNA분리와 같지만 어느 단계에서는 염색체 DNA와 분리되어야 한다.
2-1. 플라스미드 DNA의 분리
3. 제 3 타입은 파지 DNA이 며 파지 클로닝 벡터로 이용될 때 필요.
3-1. 박테리어파지 DNA의 분리
※ 아가로스 젤 전기영동장치의 원리
※ Agarose gel 전기영동시 DNA의 이동에 영향을 주는 요인들
▶ 아가로즈(아가로스, Agarose)
Ⅵ. 참고 문헌 (Reforence) |
|
|
 |
PCR은 DNA의 변성(denaturation), 프라이머의 결합(annealing), DNA의 신장(extens ion) 세 단계로 구성되어 있고, 이 과정을 반복하면서 DNA가 증폭된다.
기본적으로 PCR에 필요한 요소들에는 주형 DNA(DNA template), 프라이머(primer), 뉴클레오티드(dNTP), 중합효소(polym erase) 등이 있으며, PCR의 정확성을 결정하는 데 가장 중요한 것은 프라이머와 온도이다.
이 과정이 바로 PCR의 정확성을 결정짓는 단계이며, 온도는 프라이머의 길이와 염기의 종류에 따라 달라진다.만약에 온도가 너무 높으면 프라이머가 DNA 분자에 잘 달라붙지 않아 효율이 떨어지며, 반대로 온도가 너무 낮으면 프라이머가 다른 염기서열에 붙을 확률이 높아져 정확도가 떨어진다.
프라이머의 길이가 너무 짧으면 많은 양의 뉴클레오티드(nucleotide)로 구성된 DNA 분자를 대상으로 할 경우, 프라이머가 인식할 수 있는 구간(site)이 길어서 원하는 부분만을 증폭하는 것이 불가능해진다.
적은 양의 시료용액을 거름종이, 아세트산 셀룰로오스 종이, 폴리아크릴아미드젤, 한천젤, 녹말젤 따위의 지지체에 실은 후 전류를 통하여 주면 시료의 성분들이 점 또는 띠를 이루면서 이동한다.
아크릴아미드젤
이 두 가지 이유로 염화이온들은 글리신보다 더 빨리 이동하려 할 것이다.
SDS 젤 전기영동법
Flas k에 1XTAEbuff er55ml을 넣고 agarose 분말을 넣어 천천히 흔들어준다.
분리한 PlasmidDNA(pET-41avector)sample 준비.(실험조교가 따로 준비)
PCRp roduct(EGFP)sample 준비.
세균세포를 파괴시키는 방법에는 2가지가 있다.
DNA만 분리-단백질 제거(페놀처리), RNA 제거(Rnase 처리)
한 번의 페놀처리로 단백질이 완전히 제거되지 않는 경우, 여러 번 반복 수행한다.
페놀(1vol.) 처리 : 페놀은 비중이 높아서 가라앉는다.
어떤 RNA 분자(mRNA)는 페놀처리에 의해 제거되지만, 나머지는 그렇지 않으며 이들은 RNas e(ribonu clease)를 이용하여 분해시킨다.
플라스 미드 DNA의 분리
TotalcellDNA 분리 후 염색체 DNA와 플라스미드 DNA를 분리시킨다.
염색체 DNA와 플라스미드 DNA의 차이점 이용
조심스럽게 세포를 용해시킨다면 세균DNA의 단편화가 감소하게 되므로 원심분리에 의해 쉽게 플라스미드 DNA를 분리할 수 있다.
EtB r은 DNA의 염기 쌍 사이에 삽입됨으로써 linearDNA는 0.124g / ㎤만큼, supercoiledDNA는 0.085g / ㎤만큼 밀도를 감소시킨다(부력은 증가). 결과적으로 supercoiledDNA는 EtB r-Cs Clgradi ent에서 linear와 oc(opencircul ar) DNA와는 다른 위치에 band가 형성된다.
CsCl 밀도구배가 형성되며, EtB r에 의해 부력의 차이가 생긴 l inear&ocDNA는 상단에, supercoiledDNA는 하단에 band를 형성하게 된다.
배양 물 밀도가 너무 낮을 때- 모든 세포가 빠르게 용해(용균)됨→낮은 파지titre
배양 물 밀도가 너무 높을 때-배양물이 완전히 용해 안 됨→낮은 파지titre
배양 물 밀도가 적당할 때-배양물이 계속 증식하지만 결국에는 용해됨 →높은 파지titre
감염된 배양물로부터 파지의 수집
파지입자로부터 DNA의 분리
아가로즈의 well에 DNA를 넣어줄 때 DNA 용액을 무겁게 하여 아가 로즈의 홈으로 가라앉히는 역할을 하며 그 성분에 전기 영동되는 속도가 다른 두 개의 염색 시약이 들어있어 DNA와 같이 전기 영동되며 DNA의 전기영동된 정도를 알 수 있게 하는 역할을 한다.
이 망상구조의 특성을 이용하여 주로 DNA나 RNA의 분리에 많이 사용하는 데 gel의 양쪽에 전기장을 걸어줄 때 (-) 전기를 띈 DNA나 RNA가 전기장의 +극 쪽으로 이동하게 되는데 이때 분자량이 큰 조각일수록 이동 속도가 느려져 작은 사이즈의 조각들과 시간이 갈수록 분리되게 되며 결과 다음과 같은 사진이 만들어진다.
녹는 점과 gel화되는 온도가 낮은 아가로즈를 lowmelting아가 로즈라고 하는데 gel 내부에서 효소 반응을 시키거나 gel에서 DNA를 분리하여야 하는 경우 이런 종류의 아가로즈를 사용한다. |
 |
dna, 분리, 젤, 늘다, 단백질, 사용, 아가, 크기, 이동, 가다, 전기, 세포, 분자, 영동, 원심, 방법, 때문, 밀도, 프라이머, 경우 |
|
|
|
|
|
 |
캠벨 생명과학 포커스 2판, Lisa A. Urry 외 4명, ㈜바이오사이언스출판, 2019
핵심 일반생물학 실험서, 오병운 외 5명, ㈜바이오사이언스출판, 2018
태그 |
|
|
 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
| |
|
|
|
2023.09.25
16페이지
