PCR과 Transformation
실험 일시 :
1. Introduction
유전자를 cloning하여 vector에 주입하여 대장균에 주입하여 발현 정도를 관찰한다.
2. Materials
DNA template, primer, DW, DNA polymerase Buffer, dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), PCR tube, micro pipette, column, buffer PB, buffer NW, buffer EB, T vector, 2X Rapid Ligation Buffer, pGEM®-T or pGEM®-T Easy Vector (50 ng), PCR product, T4 DNA Ligase, gel, 도말 plate, 따뜻한 물, shaking machine
3. Methods
1) 형광 발현 유전자를 PCR로 cloning한다.
① 튜브에 DNA template 1㎕, FW primer 2㎕, RV primer 2㎕, DW 15㎕를 넣으려고 하였으나 실패의 가능성이 있으므로 각각 2배의 양으로 한다.
② 그 다음 polymerase, buffer들이 있는 PCR tube에 옮겨 담은 다음 잘 섞이도록 pipetting을 해준다. PCR tube에는 라벨링을 한다.
▶ PCR tube 속에 있는 파란 물질은 염색을 하기 위한 용도로 전기영동 시에 홈에 주입하였는지 확인을 더 쉽게 할 수 있다.
③ 94℃에서 2분 동안 진행하고 94℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 1분 30초로 한 cycle을 설정하여 35cycle을 진행한다. 그런 후 4℃에서 보관한다.
▶ cycle이나 온도, 시간의 설정은 충분히 primer가 붙을 수 있도록 설정한다.
④ 2㎕을 전기영동한다.
2) PCR산물을 분리, 정제한다.
① PCR산물의 볼륨의 5배에 해당하는 양의 buffer PB를 넣은 후에 준비된 column에 모두 옮겨 담고 30초 동안 원심분리 한다.
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2013.12.10
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