Plasmid Purification
1. 실험 목적
①plasmid의 화학적 분리법을 익힌다.
②plasmid의 정의와 특징을 알아본다.
③균의 pure culture에 대해 알아본다.
④전기영동, 원심분리 등의 사용법을 익힌다.
2.실험 원리
①Bacterial DNA는 plasmid DNA보다 훨씬 크다.
②Bacterial DNA는 여러군데가 잘려진 linear DNA 인 반면에 plasmid는 covalently covalently closed circular DNA이다. 따라서 ephidium bromide 처리시 covalently closed circular DNA는 linear DNA보다 훨씬 적게 ephidium bromide가 부착됨으로써 CsCl density ultracentrifugation하게되면, 상대적으로 높은 밀도 구배에서 band를 형성한다.
3.실험방법 및 과정
①배양
-Single colony inoculation to Test tube
-O/N culture (37℃에서 16시간동안 Shaking)
②집균
-Cell collection
-EP tube 에다가 모음(약 1.5㎖)
-10Krpm(10000rpm)에서 1min동안 원심분리를 2회 실시한다.
-실시 후 얼음에 보관한다.
-상등액을 버리고 Dry
③plasmid 분리
-★1SolⅠ을 200㎕첨가(세포벽파괴), vortex completely, dispersed(분산시킴)
-R.T(상온에서) 5min
-★2SolⅡ를 400㎕첨가, invert 5회(가볍게 섞음)
-실시후 얼음에 5분동안 보관한다.
-★3SolⅢ를 400㎕ 첨가하고 invert 10회
-실시후 얼음에 5분동안 보관한다.
-12K에서 5min동안 원심분리(상등액에 plasmid가 있음)
-상등액을 새 tube로 옮겨 담는다.
-★4상등액:chloroform 을 1:1vol로 처리한다.
-vortex 1min
-12Krpm에서 5min동안 원심분리
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2011.03.11
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